Sysmex-Partec流式細胞儀，你不知道的那些事--系列三：植物DNA檢測解析
來源：本站 作者：admin 時間：2019/1/8
【前言】
流式細胞儀最初的研究就是集中于測量發(fā)育異常的細胞遺傳物質(zhì)的數(shù)量變化，至今這項技術(shù)仍是植物生物學中評估基因組的大小和倍性水平參考方法。植物DNA水平的鑒定對植物種質(zhì)資源、物種進化、物種分類、生態(tài)學研究、倍體育種等方面具有重要意義。
【方法原理】
細胞核在提取液中機械地從約1cm2 (或20mg) 組織中提取出來，過濾后，細胞核被包含PI或者DAPI（SysmexPartec）的染色液染色，隨后在流式細胞儀上檢測。流式細胞儀需配置一個或者多個綠色（PI）、藍色（PI）和紫外（DAPI）激發(fā)光源。
圖1 植物倍性分析樣本準備步驟
【核懸液】
過濾階段可移去組織碎片，然而一些碎片并不能被完全去掉，比如葉綠體、線粒體、可溶性的分類混合物、DNA酶和RNA酶等，這些都會影響分析的質(zhì)量。加入抗氧化劑（亞硫酸鹽、巰基乙醇）、單寧（PVP）、葉綠體裂解液（Triton）、RNA溶解液（RNA酶，冰?。┑瓤梢越档瓦@些物質(zhì)對結(jié)果的干擾。
【參照物】
通常情況下，要選擇與待測樣本基因組大小相近的物種作為參照物。這個參照物需要和樣本一起制備，以降低操作中引入偏差。已知內(nèi)部參照物的DNA的重量（pg）或者堿基對（bp），通過參照物和樣本的峰值準確計算待測樣本。兩個的換算公式為：
DNA 含量(bp) = 0.978 x 109x DNA 含量 (pg)
【流式分析】
為了清除未過濾掉的細胞碎片，流式細胞術(shù)通過SSC vs FL散點圖設(shè)門。
圖2 番茄樣本的倍性分析。
A圖顯示SSCvsFL6(PI發(fā)射)，命名為“Nuclei”的門應(yīng)用與B圖中，B柱形圖顯示“Nuclei”門內(nèi)FL6峰值。
【核內(nèi)復(fù)制評估】
圖2中使用的番茄樣本顯示出核內(nèi)復(fù)制與DNA復(fù)制的相關(guān)性，如有絲分裂，但是沒有區(qū)分核和細胞自身。核內(nèi)復(fù)制的峰是疊加在經(jīng)典的細胞周期峰上的：
2C→4C→8C→16C。還可以同時查看所以核分布信息，同時一些巧合也會產(chǎn)生假的峰‘2C + 4C’。
圖3 番茄樣本中的核復(fù)制以及峰值結(jié)果統(tǒng)計
【基因組檢測】
使用流式細胞儀對DNA準確地定量分析需要非堿基特異性的、DNA嵌合型染料。主要的嵌合型染料為PI和EB。
圖4 使用已知DNA含量的大蒜作為參照物分析狗尾草的DNA含量
注：PK1 和PK2 分別為作為參照物大蒜的2C和4C的峰值，PK3 為狗尾草的峰值，從而計算出狗尾草DNA含量 = 123.97/49.50 = 2.50。2C 值計算為2.50 x 34.80 = 87.15 pg。
【AT/CG比例】
這個原理是基于DNA嵌合染料的使用相對于基數(shù)重復(fù)的熒光色素。例如，5 x AT Hoechst 33342和3 x GC 光神霉素的AT/GC比例的計算方法：
RIP=待測物熒光強度/參照物熒光強度 PI檢測
RHO=待測物熒光強度/參照物熒光強度 Hoechst 33342檢測
RCA=待測物熒光強度/參照物熒光強度 Chromomycin A3檢測
待測物AT % = 參照物AT% AT (RHO/RIP)1/5和/或 待測物GC% = 參照物GC% (RCA/RIP)1/3
最終得出的：待測物AT % +待測物GC %=100 %
【孤雌生殖和異倍體】
孤雌生殖是一種不經(jīng)過受精但產(chǎn)生種子生殖方式。其繁殖后代與母體是相同的。流式圖中的峰是由于種子的胚胎和胚乳細胞由無特定的孤雌生殖以及孤雌生殖的方式產(chǎn)生。（圖5）
圖5 使用流式細胞儀在柱形圖熒光通道里對繁殖方式的研究
對于異倍體，峰的位置會被以下出現(xiàn)的情況影響：油菜籽(Brassica napus)的染色體包含n = 16和n = 19的染色體，因此會產(chǎn)生雙峰。
【細胞周期】
在生理條件下，細胞自然呈現(xiàn)不同階段的細胞周期的DNA圖譜。
【試劑選擇】
對于植物核含量的檢測，主要的試劑為DAPI和PI，根據(jù)實驗需求和儀器配置，可以對染料進行選擇。具體區(qū)別羅列如下：
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DAPI |
PI |
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激光光源 |
365nm |
488nm或532nm |
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染色原理 |
只染色DNA |
同時染色DNA和RNA |
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熒光強度 |
強 |
弱 |
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熒光分辨率 |
高，CV<1% |
低，CV>3% |
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激光光斑 |
大，對光斑定位依賴小 |
小，對光斑定位依賴大 |
|
染料毒性 |
強 |
低 |
|
染料粘附性 |
小 |
大 |
|
染色時間 |
短，<2min |
長，>30min |
|
結(jié)果穩(wěn)定性 |
次生代謝對結(jié)果影響小 |
次生代謝對結(jié)果影響大 |
|
應(yīng)用 |
倍性分析，細胞周期 |
倍性分析，基因組大小分析，細胞周期 |
常用試劑型號
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貨號 |
英文名稱 |
中文名稱 |
測試數(shù) |
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05-5001 |
CyStain® UV Ploidy |
UV倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5002 |
CyStain® UV Precise P |
UV精確P倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5002-a |
CyStain® UV Precise P "automate" |
UV精確P倍性分析試劑盒—自動 |
2 x 1000 ml |
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05-5003 |
CyStain® UV Precise T |
UV精確T倍性分析試劑盒 |
250 tests |
|
05-5003-a |
CyStain® UV Precise T "automate" |
UV精確T倍性分析試劑盒—自動 |
2 x 1000 ml |
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05-5004 |
CyStain® DNA 1 step |
DNA一步法 |
250 tests |
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05-5005 |
CyStain® DNA 2 step |
DNA二步法 |
250 tests |
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05-5022 |
CyStain® PI Absolute P |
PI精確P倍性分析試劑盒 |
250 tests |
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05-5022-S |
CyStain® PI Absolute P |
PI精確P倍性分析試劑盒(小) |
50 tests |
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05-5023 |
CyStain® PI Absolute T |
PI精確T倍性分析試劑盒 |
250 tests |
